LAPORAN PEWARNAAN GRAM 1 ANALIS KESEHATAN

BAB I

PENDAHULUAN

A.    LATAR BELAKANG

Mikroorganisme yang ada di alam ini mempunyai morfologi, struktur dan  sifat-sifat yang khas, termasuk bakteri. Bakteri yang hidup hampir tidak berwarna dan kontras dengan air, dimana sel-sel bakteri tersebut disuspensikan. Salah satu cara untuk melihat dan mengamati bentuk sel bakteri dalam keadaan hidup sangat sulit, sehingga untuk diidentifikasi ialah dengan metode pengecatan atau pewarnaan sel bekteri, sehingga sel dapat terlihat jelas dan mudah diamati. Hal tersebut juga berfungsi untuk mengetahui sifat fisiologisnya yaitu mengetahui reaksi dinding sel bakteri melalui serangkaian pengecatan. Oleh karena itu teknik pewarnaan sel bakteri ini merupakan salahsatu cara yang paling utama dalam penelitian-penelitian mikrobiologi.

Pewarnaan Gram atau metode Gram adalah suatu metode empiris untuk membedakan spesies bakteri menjadi dua kelompok besar, yakni gram positif dan gram negatif, berdasarkan sifat kimia dan fisik dinding sel mereka. Pada uji pewarnaan Gram, suatu pewarna penimbal (counterstain) ditambahkan setelah metil ungu, yang membuat semua bakteri gram negatif menjadi berwarna merah atau merah muda. Pengujian ini berguna untuk mengklasifikasikan kedua tipe bakteri ini berdasarkan perbedaan struktur dinding sel mereka.

B.     TUJUAN PERCOBAAN

1.      Mengetahui prosedur pewarnaan gram

2.      Mengetahui bakteri gram positif dan bakteri gram negativ

BAB II

TINJAUAN PUSTAKA

Pewarnaan Gram atau metode Gram adalah suatu metode empiris untuk membedakan spesies bakteri menjadi dua kelompok besar, yakni gram positif dan gram negatif, berdasarkan sifat kimia dan fisik dinding sel mereka. Pada uji pewarnaan Gram, suatu pewarna penimbal (counterstain) ditambahkan setelah metil ungu, yang membuat semua bakteri gram negatif menjadi berwarna merah atau merah muda. Pengujian ini berguna untuk mengklasifikasikan kedua tipe bakteri ini berdasarkan perbedaan struktur dinding sel mereka.

Dalam pewarnaan gram diperlukan empat reagen yaitu :

1.      Zat warna utama (violet kristal)

2.      Mordan (larutan Iodin) yaitu senyawa yang digunakan untuk mengintensifkan warna utama.

3.      Pencuci / peluntur zat warna (alcohol / aseton) yaitu solven organic yang digunakan uantuk melunturkan zat warna utama.

4.      Zat warna kedua / cat penutup (safranin) digunakan untuk mewarnai kembali sel-sel yang telah kehilangan cat utama setelah perlakuan denga alcohol.

a)      Bakteri Gram Negatif

Bakteri gram negative adalah bakteri yang tidak mempertahankan zat warna metil ungu pada metode pewarnaan Gram. Bakteri gram positif akan mempertahankan warna ungu gelap setelah dicuci dengan alcohol, sementara bakteri gram negative tidak.

Ciri-ciri bakteri gram negatif yaitu:

1.      Struktur dinding selnya tipis, sekitar 10–15 mm, berlapis tiga atau multilayer.

2.      Dinding selnya mengandung lemak lebih banyak (11-22%), peptidoglikan terdapat didalam.

3.      Lapisan kaku, sebelah dalam dengan jumlah sedikit ± 10% dari berat kering, tidak mengandung asam tekoat.

4.      Kurang rentan terhadap senyawa penisilin.

5.      Pertumbuhannya tidak begitu dihambat oleh zat warna dasar misalnya kristal violet.

6.      Komposisi nutrisi yang dibutuhkan relatif sederhana.

7.      Tidak resisten terhadap gangguan fisik.

8.      Resistensi terhadap alkali (1% KOH) lebih pekat

9.      Peka terhadap streptomisin

b)      Bakteri Gram Positif

Bakteri gram positif adalah bakteri yang mempertahankan zat warna metil ungu sewaktu proses pewarnaan Gram. Bakteri jenis ini akan berwarna biru atau ungu di bawah mikroskop, sedangkan bakteri gram negative akan berwarna merah muda. Perbedaan klasifikasi antara kedua jenis bakteri ini terutama didasarkan pada perbedaan struktur dinding sel bakteri (Aditya,2010).

           

Ciri-ciri bakteri gram positif yaitu:

1.      Struktur dinding selnya tebal, sekitar 15-80 nm, berlapis tunggal atau monolayer.

2.      Dinding selnya mengandung lipid yang lebih normal (1-4%), peptidoglikan ada yang sebagai lapisan tunggal. Komponen utama merupakan lebih dari 50% berat ringan. Mengandung asam tekoat.

3.      Bersifat lebih rentan terhadap penisilin.

4.      Pertumbuhan dihambat secara nyata oleh zat-zat warna seperti ungu kristal.

5.      Komposisi nutrisi yang dibutuhkan lebih rumit.

6.      Lebih resisten terhadap gangguan fisik.

7.      Resistensi terhadap alkali (1% KOH) larut

8.      Tidak peka terhadap streptomisin

9.      Toksin yang dibentuk Eksotoksin Endotoksin

Bakteri gram negatif memiliki 3 lapisan dinding sel. Lapisan terluar yaitu lipoposakarida (lipid) kemungkinan tercuci oleh alkohol, sehingga pada saat diwarnai dengan safranin akan berwarna merah. Bakteri gram positif memiliki selapis dinding sel berupa peptidoglikan yang tebal. Setelah pewarnaan dengan kristal violet, pori-pori dinding sel menyempit akibat dekolorisasi oleh alkohol sehingga dinding sel tetap menahan warna biru (Fitria, 2009).

Sel bakteri gram positif mungkin akan tampak merah jika waktu dekolorisasi terlalu lama. Sedangkan bakteri gram negatif akan tampak ungu bila waktu dekolorisasi terlalu pendek (Fitria, 2009).

Perbedaan relative sifat bakteri gram positif dan gram negative

SIFAT	BAKTERI GRAM (+)	BAKTERI GRAM (-)
Komposisi dinding sel	Kandungan lipid rendah (1-4 %)	Kandungan lipid tinggi
Ketahanan terhadap penisilin	Lebih sensitif	Lebih tahan
Penghambat oleh pewarna basa (VK)	Lebih dihambat	Kurang dihambat
Kebutuhan nutrisi	Kebanyakan spesies relatif kompleks	Relatif sederhana
Ketahanan terhadap perlakuan fisik	Lebih tahan	Kurang tahan

(Manurung, 2010).

BAB III

METODE PERCOBAAN

A.    WAKTU DAN TEMPAT PERCOBAAN

Praktikum dilaksanakan hari Sabtu, tanggal 23 April 2016 pukul 13.00-15.00 WITA. Bertempat diLaboraturium Mikrobiologi Jurusan Analis Kesehatan STIKes MEGA REZKY MAKASSAR.

B.     ALAT DAN BAHAN

                               I.            Alat

§  Mikroskop

§  Ose

§  Kaca Objek

§  Bak Pewarna

§  Spiritus

                            II.            Bahan

§  Biakan Bakteri Pseudomonas aerogenosa

§  Larutan (Kristal violet, lugol, alcohol, air fuchsin)

C.    PROSEDUR KERJA

1.       Dibuat preparat ulas, kemudian didinginkan lalu difiksasi diatas api

2.      Diteteskan Kristal violet sebagai pewarna utama pada kedua preparat, diusahakan semua ulasan terwarnai dan tunggu selama ± 1 menit

3.      Dicuci dengan aquadest mengalir

4.      Diteteskan mordant (lugol iodine) lalu ditunggu ± 1 menit

5.      Dicuci dengan aquadest mengalir

6.      Diberikan larutan pemucat, jangan sampai terlalu banyak

7.      Dicuci dengan aquadest mengalir

8.      Diteteskan dengan safranin dan ditunggu selama ± 45 detik

9.      Dicuci dengan aquadest mengalir, kemudian dikeringkan

10.  Diamati dibawah mikroskop

BAB IV

HASIL DAN PEMBAHASAN

A.    HASIL PENGAMATAN

 

                                                                             

Bahan              : Biakan bakteri Pseudomonas aerogenosa

Morfologi        : Berbentuk batang lurus atau lengkung

Warna              : Merah

Perbesaran       : 10-40 x

Bakteri Gram : Negatif

B.     PEMBAHASAN

Pewarnaan gram ini bertujuan untuk mlihat bakteri bersifat gram positif atau negatif dan bentuknya. Pewarnaan Gram adalah pewarnaan diferensial yang sangat berguna dan paling banyak digunakan dalam laboratorium mikrobiologi, karena merupakan tahapan penting dalamlangkah awal identifikasi. Pewarnaan ini didasarkan pada tebal atau tipisnya lapisan peptidoglikan di dinding sel dan banyak sedikitnya lapisan lemak pada membran sel bakteri.

Penambahan violet pada bakteri. Kristal violet merupakan reagen yang berwarna ungu.Kristal violet ini merupakan pewarna primer (utama) yang akan memberi warna pada mikroorganisme target. Kristal violet bersifat basa sehingga mampu berikatan dengan sel mikroorganisme yang bersifat asam. Dengan perlakuan seperti itu, sel mikroorganisme yang transparan akan terlihat berwarna (ungu). Pemberian kristal violet pada bakteri gram positif akan meninggalkan warna ungu muda. Perbedaan respon terhadap mekanisme pewarnaan gram pada bakteri adalah didasarkan pada struktur dan komposisi dinding sel bakteri. Bakteri gram positif mengandung protein dan gram negatif mengandung lemak dalam persentasi lebih tinggi dan dinding selnya tipis. Kristal violet yang diteteskan didiamkan selama 1 menit bertujuan agar cat atau pewarna ini dapat melekat sempurna pada dinding sel bakteri.

Penambahan lugol pada bakteri. Lugol merupakan pewarna Mordan, yaitu pewarna yang berfungsi memfiksasi pewarna primer yang diserap mikroorganisme target atau mengintensifkan warna utama. Pemberian lugol pada pengecetan gram dimaksudkan untuk memperkuat pengikatan warna oleh bakteri. Kompleks zat lugol terperangkap antara dinding sel dan membrane sitoplasma organism gram positif, sedangkan penyingkiran zat lipida dari dinding sel organisme gram negative dengan pencucian alkohol memungkinkan hilang dari sel. Lugol yang diteteskan didiamkan selama 1 menit bertujuan agar pengikatan warna oleh bakteri menjadi semakin lebih kuat.

Selanjutnya, 1 tetes alkohol 96% diteteskan diatas object glass tersebut kemudian didiamkan selama 45 detik. Setelah itu kaca objek dibilas dengan air hingga warnanya hilang. Etanol 95% merupakan solven organik yang berfungsi untuk membilas (mencuci) atau melunturkan kelebihan zat warna pada sel bakteri (mikroorganisme). Tercuci tidaknya warna dasar tergantung pada komposisi dinding sel, bila komponen dinding sel kuat mengikat warna, maka warna tidak akan tercuci sedangkan bila komponen dinding sel  tidak kuat menelan dinding dasar, maka warna akan tercuci. Pemberian alkohol pada pengecetan ini dapat mengakibatkan terjadinya dua kemungkinan yaitu bakteri akan tetap bewarna ungu atau bakteri menjadi tidak bewarna. Pemberian alkohol 96% juga menyebabkan terekstraksi lipid sehingga memperbesar permeabilitas dinding sel.

Selanjutnya diteteskan 1 tetes safranin di atas kaca objek tersebut kemudian didiamkan selama 1 menit. Setelah itu, kaca objek dibilas dengan air hingga warnanya hilang. Safranin merupakan pewarna tandingan atau pewarna sekunder. Zat ini berfungsi untuk mewarnai kembali sel-sel yang telah kehilangan pewarna utama setelah perlakuan dengan akohol. Dengan kata lain, safranin memberikan warna pada mikroorganisme non target serta menghabiskan sisa-sisa cat atau pewarna. Pewarnaan safranin masuk ke dalam sel dan menyebabkan sel menjadi berwarna merah pada bakteri gram negatif sedangkan pada bakteri gram positif dinding selnya terdehidrasi dengan perlakuan alkohol, pori-pori mengkerut, daya rembes dinding sel dan membrane menurun sehingga pewarna safranin tidak dapat masuk sehingga sel berwarna ungu.

Pemberian reagen atau pewarna yang berganti dari satu pewarna ke pewarna lain dengan waktu yang telah ditentukan disebabkan dengan zat-zat warna tersebut dapat berikatan dengan komponen dinding sel bakteri dalam waktu singkat. Karena itulah rentan waktu pemberian zat warna yang satu ke yang lainnya tidak lama sehingga proses identifikasi bakteri berlangsung cepat.

Setiap akhir pemberian reagent atau pewarna, selalu dilakukan pembilasan terhadap kaca objek dengan menggunakan air. Pembilasan ini bertujuan untuk mengurangi kelebihan setiap zat warna yang sedang diberikan. Setiap akhir pembilasan pada masing-masing reagent, perlu dilakukan penyerapan air bilasan dari air dengan menggunakan kertas tissue agar aquadest tidak tercampur dengan reagent atau pewarna baru yang akan diberikan. Setelah pembilasan terakhir, gelas benda dikeringkan dan diamati di bawah mikroskop. Jika terbentuk warna ungu maka termasuk golongan bakteri gram  positif, dan jika terbentuk warna merah maka termasuk golongan bakteri gram negatif.

BAB V

PENUTUP

A.    KESIMPULAN

Dari praktikum ini dapat disimpulkan bahwa, bakteri Pseudomonas aerogenosa berwarna merah yang merupakan bakteri gram negative.

B.     SARAN

Setelah melakukan praktikum. Diharapkan kepada praktikan agar melakukan praktikum dengan sungguh-sungguh dan berhati-hati dalam melakukan percobaan serta menggunakan alat pelindung diri (APD).