BAB I
PENDAHULUAN
A.
LATAR
BELAKANG
Mikroorganisme
yang ada di alam ini mempunyai morfologi, struktur dan sifat-sifat yang khas, termasuk bakteri.
Bakteri yang hidup hampir tidak berwarna dan kontras dengan air, dimana sel-sel
bakteri tersebut disuspensikan. Salah satu cara untuk melihat dan mengamati
bentuk sel bakteri dalam keadaan hidup sangat sulit, sehingga untuk
diidentifikasi ialah dengan metode pengecatan atau pewarnaan sel bekteri,
sehingga sel dapat terlihat jelas dan mudah diamati. Hal tersebut juga berfungsi
untuk mengetahui sifat fisiologisnya yaitu mengetahui reaksi dinding sel
bakteri melalui serangkaian pengecatan. Oleh karena itu teknik pewarnaan sel
bakteri ini merupakan salahsatu cara yang paling utama dalam
penelitian-penelitian mikrobiologi.
Bakteri tahan
asam adalah bakteri yang mempertahankan zat warna karbol-fuchsin (fuchsin
basayang dilarutkan dalam suatu campuran phenol-alkohol-air) meskipun dicuci
dengan asam klorida dalam alkohol. Sediaan sel bakteri pada gelas alas disiram
dengan cairan karbol fuchsin kemudian dipanaskan sampai keluar uap. Setelah
itu, zat warna dicuci dengan asam alkohol dan akhirnya diberi warna kontras
(biru atau hijau). Bakteri-bakteri tahan asam (spesies Mycobakterium dan beberapa Actinomycetes
yang serumpun) berwarna merah dan yang lain-lain akan berwarna sesuai warna
kontras.
Mycrobakteria adalah bakteri aerob berbentuk batang, yang tidak membentuk spora.
Walaupun tidak mudah diwarnai bakteri ini tahan terhadap penghilangan warna
(deklorisasi) oleh asam atau alkohol dan karena itu dinamakan basil tahan asam.
Ciri –ciri khas Mycobakterium
tuberculosis dalam jaringan, basil tuberkel merupakan batang ramping lurus
berukuran kira-kira 0,4 x 3 µm.
B.
TUJUAN
PERCOBAAN
Mempelajari cara melakukan prosedur pewarnaan
tahan asam dan memahami dasar-dasar kimiawi reaksi tahan asam
BAB II
TINJAUAN PUSTAKA
Bakteri tahan asam
adalah jenis bakteri yang tidak dapat diwarnai dengan pewarnaan anilin biasa
kecuali dengan menggunakan fenol dan dengan pemanasan. Bakteri ini memilki
dinding sel berlilin karena mengandung sejumlah besar materi lipoidal oleh
karena itu bakteri ini hanya dapat diwarnai dengan pewarnaan BTA (Acid-Fast
Stain). Dinding sel hidrofobik dan impermeabel terhadap pewarnaan dan bahan
kimia lain pada cairan atau larutan encer. Ketika proses pewarnaan, bakteri
tahan asam ini melawan dekolorisasi dengan asam sehingga bakteri tersebut
disebut bakteri tahan asam (Lay, 1994)
Bakteri
tahan asam merupakan bakteri yang kandungan lemaknya sangat tebal sehingga
tidak bisa diwarnai dengan reaksi pewarnaan biasa, tetapi harus dengan
pewarnaan tahan asam. Kelompok bakteri ini disebut bakteri tahan asam
(BTA) karena dapat mempertahankan zat warna pertama sewaktu dicuci dengan
larutan pemucat. Golongan bakteri ini biasanya bersifat patogen pada
manusia contohnya adalah Mycobacterium tuberculosis. Bakteri Mycobacterium tuberculosis dapat
diisolasi dari sputum penderita TBC. Reaksi hasil pewarnaannya jika
positif terdapat bakteri TBC berwarna merah. Selain menyerang manusia
juga menyerang hewan seperti marmut, dan kera. Penularannya dapat melalui udara
yang masuk ke saluran pernafasan (Pelczar, 1986)
Contoh
dari bakteri tahan asam yaitu dari genus Mycobacterium
Bakteri ini memiliki sejumlah besar zat lipoidal (berlemak) di dalam dinding
selnya sehingga menyebabkan dinding sel tersebut relative tidak permeabel
terhadap zat-zat warna yang umum sehingga sel-sel bakteri tersebut tidak
terwarnai oleh metode pewarnaan biasa, seperti pewarnaan sederhana atau
pewarnaan gram (Pelczar, 1986).
Mycobacterium
tuberculosis termasuk gram positif,
berbentuk batang panjang atau pendek, tidak berspora,
tidak berkapsul, pertumbuhan sangat ambat (2-8 minggu), suhu optimal 37-380C yang merupakan suhu
normal manusia. Pertumbuhannya membutuhkan tambahan makanan seperti darah, egg
yolk, serum, dan bahan kimia tertentu. Dalam jaringan, basil tuberkel adalah
bakteri batang lurus dengan ukuran sekitar 0,4 – 3 μm. Pada media buatan,
bentuk kokoid dan filamentous tampak bervariasi dari satu spesies ke spesies
lain. Segera setelah diwarnai dengan pencelupan dasar mereka tidak dapat
didekolorisasi oleh alkohol, tanpa memperhatikan pengobatan dengan
iodine. Basil tuberkel secara umum dapat diwarnai dengan pewarnaan Ziehl-Neelsen.
Media untuk membiakan mikobakteria adalah media nonselektif dan media selektif.
Media selektif berisi antibiotik untuk mencegah pertumbuhan kontaminan bakteri
dan fungi yang berlebihan. Ada tiga formulasi umum yang dapat digunakan untuk
kedua media nonselektif dan selektif, yaitu media agar semisintetik
(middlebrook 7H10 dan 7H11), media telur inspisasi (Lowenstein-jensen), media
kaldu (broth media)
Mycobacterium merupakan aerobik obligat yang
memperoleh energi dari oksidasi beberapa senyawa sederhana. Penambahan CO2
meningkatkan pertumbuhan. Tidak ada aktivitas biokimia yang menandai. Dan
kecepatan pertumbuhan lebih rendah dari pada sebagian besar bakteri.
Waktu untuk menggandakan basil tuberkel sekitar 18 jam, bentuk saprofit
cenderung tumbuh lebih cepat, poliferasi terjadi pada temperatur 22-23˚C, untuk
menghasilkan pigmen yang lebih banyak dan mengurangi bentuk ”cepat asam”
daripada bentuk patogenik. Mikobakteria cenderung lebih resisten terhadap agen
kimia daripada bakteri lain karena sifat hidrofobik permukaan sel dan
pertumbuhannya. Basil tuberkel reisten terhadap kekeringan dan bertahan
hidup selama periode waktu yang lama dalam sputum kering. Variasi dapat terjadi
dalam koloni, pigmentasi, virulensi, temperatur petumbuhan yang optimal
dan beberapa tanda pertumbuhan atau seluler lainnya (Sechlegel, 1994)
Teknik pewarnaan
Ziehl-Neelsen, yaitu dengan menggunakan zat warna carbol fuchsin 0,3 %, asam
alkohol 3 %, dan methylen blue 0,3%. Pada pemberian warna pertama, yaitu
carbol fuchsin, BTA bersifat mempertahankannya. Carbol fuchsinmerupakan fuksin
basa yang dilarutkan dalam larutan fenol 5 %. Larutan ini memberikan warna
merah pada sediaan dahak. Fenol digunakan sebagai pelarut untuk membantu
pemasukan zat warna ke dalam sel bakteri sewaktu proses pemanasan. Fungsi
pemanasan untuk melebarkan pori-pori lemak BTA sehingga carbol fuchsin dapat
masuk sewaktu BTA dicuci dengan larutan pemucat, yaitu asam alkohol, maka zat
warna pertama tidak mudah dilunturkan. Bakteri kemudian dicuci dengan air
mengalir untuk menutup pori-pori dan menghentikan pemucatan. BTA akan terlihat
berwarna merah, sedangkan bakteri yang tidak tahan asam akan melarutkan carbol
fuchsin dengan cepat sehingga sel bakteri tidak berwarna. Setelah penambahan
zat warna kedua yaitu methylen blue, bakteri tidak tahan asam akan berwarna
biru (Lay, 1994).
Pada
pewarnaan bakteri dengan metode Ziehl- Neelsendapat menggolongkan bakteri
menjadi dua, yaitu :
1.
Bakteri
yang berwarna merah dengan pewarnaan Ziehl-Neelsen disebut bakteri tahan
asam (acid fast )
2.
Bakteri
yang berwarna biru dengan pewarnaan Ziehl-Neelsen disebut bakteri tidak
tahan asam (non acid fast ).
BAB II
METODE PERCOBAAN
A.
WAKTU
DAN TEMPAT PERCOBAAN
Praktikum dilaksanakan hari Sabtu,
tanggal 30 April 2016 pukul 13.00-15.00 WITA. Bertempat diLaboraturium
Mikrobiologi Jurusan Analis Kesehatan STIKes MEGA REZKY MAKASSAR.
B.
ALAT
DAN BAHAN
I.
Alat
§ Mikroskop
§ Ose
§ Kaca
Objek
§ Bak
Pewarna
§ Spiritus
II.
Bahan
§ Sputum
§ Larutan
(karbol fuksin, alkohol dan methylen blue)
C.
PROSEDUR
KERJA
1. Dibersihkan
kaca preparat
2. Dibuat
preparat ulas dari sampel sputum, kemudian diangin-anginkan. Lalu difiksasi
3. Diteteskan
karbol fuchsin, kemudian preparat dipanaskan selama 5 menit sampai terjadi uap.
Lalu didinginkan
4. Preparat
dicuci dengan air mengalir
5. Ditambahkan
larutan pemucat selama 20 detik, lalu dicuci
6. Diwarnai
dengan metilen blue selama 1 menit dan dicuci dengan air mengalir
7. Dikeringkan,
lalu diamati dibawah mikroskop
BAB IV
HASIL DAN PEMBAHASAN
A.
HASIL
PENGAMATAN
 |
1. Bahan : Sputum
Morfologi : Berbentuk batang lurus atau tongkat
Warna : Merah
Perbesaran : 40 x
Sifat bakteri : Bakteri tahan asam
2. Bahan : Sputum
Morfologi : Berbentuk batang lurus atau tongkat
Warna : Biru
Perbesaran : 40 x
Sifat bakteri : Bakteri tidak tahan asam
B.
PEMBAHASAN
Pada praktikum ini
dilakukan teknis aseptis, hal ini bertujuan untuk mencegah atau meminimaliskan
adanya kontaminasi mikroorganisme baik pada sampel atau praktikan
sendiri. Pada praktikum kali ini dilakukan pewarnaan tahan asam untuk
mengidentifikasi dan mengamati bakteri yang bersifat tahan asam, bakteri ini
disebut tahan asam karena akan mempertahankan zat warna perimer ketika
ditambahkan larutan asam, bakteri ini memiliki rantai karbon 8-95 dan dinding
selnya terdiri dari lapisan lilin, asam lemak mikolat, dan lipid sampai 60 %
dari berat dinding selnya, sehingga dengan tebalnya kadar lipid pada
dinding sel menyebabkan bakteri ini sulit
untuk dilakukan dengan pewarnaan biasa
dan perlu perwarnaan khusus.
Pada praktikum ini
menggunakan pewarnaan ziehl neelsen untuk identifikasi dan pengamatan bakteri
tahan asam, karena metode ini merupakan salah satu metode pengujian bakteri
tahan asam yang cukup sederhana dan memiliki spesipisitas dan sensitivitas yang
cukup tinggi. Pada praktiknya hal yang pertama dilakukan adalah pengolesan
sampel pada kaca preparat secara aseptis dalam hal ini sampel yang digunakan
merupakan Mycrobacterium tuberculosis,
dengan mengambil kaca preparat yang terendam dalam etanol kemudian dikeringkan
dengan kapas sampai benar-benar kering, perendaman kaca preparat ini bertujuan
untuk membunuh bakteri dari praktikum sebelumnya yang masih melekat pada
permukaan kaca preparat. Dimana etanol ini memiliki dua mekanisme dalam
membunuh bakteri yakni dengan denaturasi protein dan pelarutan membrane lemak
pada bakteri. Setelah kaca preparat kering selanjutnya dibuat pola
lingkaran pada bagian belakang kaca preparat yang berfungsi sebagai tanda
olesan bakteri atau sampel. Kemudiaan menyalakan api spiritus untuk melakukan
fiksasi dan menjaga agar lingkungan pada proses pemindahan sampel dari
cawan petri ke kaca preparat tetap dalam keadaan steril atau mencegah
kontaminan lain masuk ke dalam sampel. Hal pertama yang dilakukan adalah
fiksasi ose terlebih dahulu untuk mencegah adanya kontaminan yang menempel pada
ose, fiksasi ose ini dilakukan dari ujung kawat dekat batang kaca ose menuju
ujung loop ose, hal ini dilakukan agar panas yang dihantarkan merata serta jika
ose dalam keadaan basah tentu sisa larutan pada ujung loop ose akan lebih
efisien untuk dikeringkan dengan cara ini, selanjutnya ose dibiarkan dingin di
tempat yang masih dekat dengan panas spiritus hal ini bertujuan agar ketika ose
dimasukan ke dalam sampel tidak menyebabkan bakteri yang terkandung dalam
sampel mati akibat panas dari ose. Selanjutnya mengambil sampel sebanyak satu
loop ose dalam keadaan aseptis,dan oleskan ke atas kaca preparat, dimana teknik
pengolesan sampel harus diperhatikan karena jika olesan terlalu tebal,
maka sel-sel bakteri akan bertumpuk-tumpuk sehingga sulit untuk menentukan
bentuk sel individu dan jika olesan terlalu tipis dapat menylulitkan pengamatan
secara mikroskopis. Selanjutnya dilakukan fiksasi pada sampel, yang bertujuan
untuk merekatkan sel bakteri pada preparat objek, setelah itu sampel yang
telah difiksasi digenangi denga karbol fuksin selama 5 menit dan dilakukan
pemanasan, lama waktu yang dibutuhkan bertujuan untuk agar zat warna karbol
fuksin ini dapat berpenetrasi secara sempurna ke dalam dinding sel bakteri, dan
dimana karbol fuksin ini merupakan zat pewarna primer yang mengandung fucsin
basa dan fenol, sehingga dengan adanya fenol pada karbol fuksin ini dapat
berfungsi untuk melunakan lapisan lilin pada dinding sel bakteri sehingga
cat warna fuksin dapat masuk ke dalam sel, hal ini tentu dibantu dengan proses
pemanasan yang mengakibatkan terbukanya pori-pori lemak yang menutupi dinding
sel bakteri sehingga fungsi fenol pada karbol fuksin dapat berjalan
dengan baik, namun pada pemanasan ini sampel harus dijaga jangan sampai
mengering atau terlalu panas karena akan menyebabkan bakteri mati dan tidak
akan dapat teridentifikasi. Selanjutnya dilakukan pencucian dengan mengaliri
aquadest pada sampel, hal ini bertujuan untuk mencegah adanya kelebihan zat
warna pada sampel, kemudian ditambahkan asam alcohol selama 15 detik,
penambahan ini diperlukan untuk melakukan pemucatan pada bakteri yang dimana
hal ini akan menentukan bakteri tersebut tahan asam atau tidak dimana
jika bakteri bersifat tahan asam, bakteri tersebut tidak akan melepaskan
zat warna primer sebelumnya, namun jika non BTA maka bakteri akan melepaskan
zat warna primernya.
Penambahan asam alcohol
ini tidak boleh dilakukan secara berlebihan karena akan menyebabkan
overdekolorization sehingga BTA dan non BTA tidak dapat dipisahkan, namun
jangan pula terlalu sedikit dalam penambahan asam alcohol pada bakteri karena
akan menyebabkan underdecolorization yang dapat menyebabkan zat warna pada non
BTA tidak seluruhnya terlepas yang mengakibatkan terjadinya ketidak akuratan
dalam proses identifikasi dan pengamatan apda sampel. Selanjutnya dialiri
aquadest untuk menutup pori-pori bakteri sehingga tidak terjadi lagi proses
pemucatan oleh asam alcohol, dan dikeringkan dengan kertas saring untuk
menyerap kelebihan aquadest pada sampel bakteri. Kemudian preparat sampel
bakteri digenagi dengan metilen blue yang berfungsi sebgai pewarna tandingan,
dimana pewarna ini yang akan menunjukan adanya bakteri non tahan asam, karena
bakteri ini akan melepaskan pewarna primer dan menyerap pewarna sekunder
atau tandingan. Kemudian dibilas dengan aquadest yang berfungsi untuk mencegah
adanya kelebihan zat warna pada sampel, selanjutnya dikeringkan dengan kertas
saring yang berfungsi unuk menyerap kelebihan aquadest pada sampel,
selanjutnya ditambahkan minya emersi karena cahaya yang datang dibiaskan
melalui 2 medium yang berbeda, yaitu udara dan kaca.
Dibutuhkan suatu bahan
yang mampu membiaskan cahaya dari medium udara dan medium kaca dengan
pembiasan cahaya dari medium udara dan medium kaca dengan pembiasan
yang mendekati garis normal adalah minyak emersi. Selain itu, minyak emersi
juga mempunyai indeks bias yang mendekati atau identik dengan kaca,sehingga
dapat memfokuskan sampel bakteri pada pengamatan mikroskop, Setelah
ditambahkan minyak emersi dilakukan pengamatan dengan menggunakan mikroskop
pada perbesaran 40 x, berdasarkan hasil praktikum ini diperoleh hasil
pengamatan latar belakang berwarna biru terang dan basil bakteri berwarna
merah pucat , hal ini menunjukan adanya bakteri tahan asam pada sampel yakni
berupa Mycrobacterium tuberculosis,
dan didapatkan bakteri basil berwarna biru yang menunjukkan adanya bakteri
tidak tahan asam pada sampel yakni berupa Mycrobacterium
tuberculosis, bakteri ini bersifat pathogen di dalam tubuh baik pada
manusia maupun hewan, dan bersifat kronis karena mebutuhkan waktu yang lama
agar menimbulkan infeksi pada host nya, berbentuk batang langsing, lurus atau
berbentuk filament. Bakteri ini bersifat aerobik, tidak membentuk spora, non
motil, tahan asam, dan merupakan bakteri gram positif.
BAB V
PENUTUP
A.
KESIMPULAN
Berdasarkan pengamatan yang di bawah
mikroskop, maka dapat disimpulkan bahwa:
1. Pada
preparat I ditemukan bakteri berbentuk
basil berwarna merah yang merupakan bakteri tahan asam.
2. Pada
preparat II ditemukan bakteri berbentuk basil berwarna biru yang merupakan
bakteri tidak tahan asam
B.
SARAN
Setelah melakukan praktikum. Diharapkan
kepada praktikan agar melakukan praktikum dengan sungguh-sungguh dan
berhati-hati dalam melakukan percobaan serta menggunakan alat pelindung diri
(APD).
DAFTAR PUSTAKA
Lay,
B. W. 1994. Analisis Mikroba di Laboratorium. Jakarta: PT. Raga Grafindo
Persada.
Pelczar, M. J. And E. C. S. Chan. 1986. Elements of
Mycrobiology. New York : Mc grow-Hill Book Company.
Sechlegel, H. G. And Schimt, K. 1994. Mikrobiologi
Umum. Yogyakarta : UGM Press.
Tidak ada komentar:
Posting Komentar